Metody Biofizyki Molekularnej Krystalografia białek

.Strukturę przestrzenną białek złożonych maksymalnie z ok.370 aminokwasów możemy uzyskaćdzięki badaniom NMR.W przypadku większych białek stosuje się metody krystalograficzne.Odległości między obiektami i ich wielkości nie mogą być wyznaczane z rozdzielczością większą niżdługość fali promieniowania za pomocą której oświetlamy układ.Aby uzyskać dane z rozdzielczościąatomową potrzebne jest promieniowanie o odpowiednio krótkiej długości fali.Dlatego do określaniastruktury makromolekuł stosujemy promieniowanie rentgenowskie.Spis treści1 Historia2 Etapy uzyskiwania struktury białka3 Czynniki wpływające na krystalizacje białek3.1 Diagram fazowy3.2 Jak w sposób kontrolowany przenieść białko do strefy przesycenia?3.3 Odparowywanie wody3.4 Optymalizacja środowiska krystalizacji3.5 Inne czynniki, które wpływają na wzrost kryształów białkowych4 Techniki uzyskiwania kryształów białek5 Kryształy białkowe6 Fale6.1 Prawo Braggów6.2 Transformata Fouriera6.3 Splot funkcji6.4 Ważne zależności6.5 Dyfrakcja6.5.1 Obraz dyfrakcyjny7 W jaki sposób informacja o strukturze obiektu zakodowana jest w jego obrazie dyfrakcyjnym?7.1 Dyfrakcja na układzie szczelin7.1.1 Wnioski dla dwuwymiarowego układu szczelin przenoszą się natrójwymiarowy7.2 Dyfrakcja w sieci przestrzennej kryształu7.2.1 Płaszczyzny7.2.1.1 Okrąg (sfera) Ewalda7.2.1.2 Rozpraszanie na kryształach to rozpraszanie.7.2.1.3 Fala ugięta przez ciągły rozkład elektronów8 Sposoby rozwiązywania problemu fazowego:8.1 Funkcja Pattersona8.2 Metoda wielokrotnego podstawienia izomorficznego8.3 Rozpraszanie anomalne8.4 Metoda podstawienia molekularnego8.5 Udokładnianie struktury9 Zbieranie danych dyfrakcyjnych9.1 Najczęściej stosowane metody9.2 yródła promieniowania HistoriaW 1840 roku F.L.Hunefeld opisał przypadkowo powstałe kryształy hemoglobiny dżdżownicy.W 1912 roku Max von Laue przeprowadził pierwsze doświadczenie ugięcia promieniowaniarentgenowskiego na krysztale.*Rok pózniej William Henry Bragg i jego syn William LawrenceBragg rozwiązali struktury kilku minerałów.W 1934 roku Arthur Lindo Patterson wyprowadził nazwaną od jego nazwiska funkcjęPattersona, która umożliwia rozwiązanie problemu fazowego dla struktur zawierających atomciężkiego pierwiastka.Na początku lat 30.XX wieku pojawiły się pierwsze zdjęcia dyfrakcji: na włóknach białek wlaboratorium Williama Astbury'ego i na monokryształach w laboratorium Desmonda Bernala.W 1951 roku Linus Pauling na podstawie obserwacji krystalograficznych i właściwości wiązańchemicznych zapostulował struktury alfa-helisy i beta-kartki, jako główne motywy w białkach(Nagroda Nobla 1954).Pod koniec lat 50.XX wieku John Kendrew opublikował pierwszą w dziejach strukturę białka,mioglobiny wieloryba.*W tym samym czasie Max Perutz opublikował strukturę hemoglobiny.W 1953 roku Rosalind Franklin zarejestrowała zdjęcia rentgenowskie włókien DNA.W 1965 roku uzyskano pierwszą strukturę lizozymu z białka jaja kurzego.W 1971 rokuutworzono Bank Struktur Białkowych (Protein Data Bank, PDB), w którym zdeponowano 7struktur białek.W roku 1973 w PDB było zdeponowanych 9 struktur białkowych.Powolny początkowo rozwój rentgenografii białek wynikał z braku silnych zródełpromieniowania rentgenowskiego.W latach 70-tych nastąpił skok jakościowy związany zzastosowaniem synchrotronów jako zródeł promieniowania rentgenowskiego, wprowadzeniemprogramowalnych maszyn cyfrowych, oraz rozwojem inżynierii genetycznej i biotechnologii.Etapy uzyskiwania struktury białkaDo etapów uzyskiwania białka odpowiedniego do badań krystalograficznych, a następnie określaniastruktury krystalograficznej należą:1.Oczyszczanie.2.Krystalizacja (uzyskanie dobrze rozpraszającego monokryształu).3.Wstępna analiza dyfrakcyjna (grupa przestrzenna, zdolność rozdzielcza, stabilność w wiązce).4.Zebranie pełnych danych dyfrakcyjnych5.Rozwiązanie problemu fazowego odpowiednią metodą:1.Podstawienia molekularnego2.Anomalnego rozpraszania3.Podstawienia izomorficznego pochodnych z ciężkimi atomami6.Utworzenie mapy gęstości elektronowej7.Interpretacja mapy, udokładnienie struktury8.Prezentacja graficzna uzyskanej struktury białkaCzynniki wpływające na krystalizacje białek Diagram fazowyNa rozpuszczalność białek wpływają  czynniki wytrącające (precypitanty): np.: sole, glikolpolietylenowy.Diagram fazowy zależności stężenia białka od stężenia precypitanta jestprzedstawiony na Rys.Figure 1.Diagram fazowy dla hipotetycznego białka w funkcjistężenia precypitanta.(i)Dla wysokich stężeń białka i precypitanta białko wytrącasię w postaci amorficznych agregatów.(ii)Dla niższych stężeń mogą tworzyć się jądra krystalizacji,a następnie rozpraszające kryształy.(iii)Dla jeszcze niższych stężeń, w strefie metastabilnej, nietworzą się jądra krystalizacji, ale umieszczenie kryształubiałka w takim roztworze powoduje jego wzrost.(iv)Dla najniższych stężeń białka są całkowicierozpuszczalne.Jak w sposób kontrolowany przenieść białko do strefy przesycenia?Dodać precypitant.Suszyć kroplę cieczy zawierającej białko.Wymieniać bufor (dializa).Czekać i regularnie obserwować eksperyment pod mikroskopem.Odparowywanie wodyRozpuszczone białko umieszcza się w kropli (~5 ml) ponad lub obok rezerwuaru z buforemzawierającym większe stężenie czynnika wytrącającego.Kropla i rezerwuar ulegają równoważeniuwymieniając wodę.Osiągany zostaje stan przesycenia, tworzone są zarodzie krystalizacji i następujewzrost kryształów.Skład roztworu do krystalizacji (sól, bufor, precypitant) wpływa na rozpuszczalność białek. Ze zmiana pH niektóre aminokwasy (np.Asp, Glu, Lys, His, Arg, Try) zmieniają stannaładowania (z obojętnego na naładowany lub odwrotnie).Zawartość soli wpływa na ładunek powierzchniowy białka i oddziaływania z cząsteczkamiwody.Wsalanie ( dodanie soli zwiększa rozpuszczalność białek) lub wysalanie (dodawanie solizmniejsza rozpuszczalność białek)Rozpuszczalniki polarne np.Glikol polietylenowy (PEG) wiąże cząsteczki wody.Optymalizacja środowiska krystalizacjiZakres krystalizacji białek to przedział 2  50 mg/ml.Przeprowadzenie testu PCT (Pre-crystallization test, Hampton Research)  pozwala naustalenie granic stężenie białka zdolnego do krystalizacji pomiędzy precypitatem a przejrzystakroplą.Temperatura i jej fluktuacje: białka zwykle krystalizują w zakresie temperatur 4  45C, alezdarzają się wyjątki np.glukagon (60C).Najczęściej dwie równoległe hodowle wtemperaturach 4C i 20C.Pożądana czystość (homogeniczność białka  chemiczna, izomeryczna, konformacyjna,oligomeryczna) testowana z wykorzystaniem m.in.elektroforezy natywnej (obserwuje siękorelację pomiędzy heterogenicznością oligomeryczną białka a jego zdolnością dokrystalizacji).Inne czynniki, które wpływają na wzrost kryształów białkowychDodatki  jony metali, ligandy,organizm, z którego wyizolowano białko,grawitacja, konwekcja, sedymentacja,drgania, dzwięki,objętość próbki,ciśnienie,proteoliza,lepkość roztworu,zanieczyszczenia,pole elektryczne i magnetyczne itp&Należy szukać wielu możliwych warunków krystalizacji (w niektórych uzyskuje się małe kryształy, okształcie igły, słabo rozpraszające promieniowanie rentgenowskie).Jeśli nie uzyskamy w pierwszym podejściu kryształów odpowiednich do badań dyfrakcyjnych tonależy zanotować obserwowane typy wytrąceń.Mogą to być wytrącenia amorficzne, nieamorficznelub mikrokryształy.Doświadczony  badacz może na podstawie typu wytrącenia zaplanować dalszeetapy postępowania w celu uzyskania kryształu.Techniki uzyskiwania kryształów białek1.Metoda wiszącej kropli.Najbardziej rozpowszechniona technika.Białko z roztworem zawierającym precypitant jest mieszane w stosunku 1:1. Kropla umieszczana jest na silikonowanej płytce, którą zawiesza się nad zbiornikiem zroztworem.Woda paruje z kropli do wyrównania stężeń precypitanta pomiędzy zbiornikiem a kroplązawierającą białko.Zwiększanie stężenia białka i precypitanta powoduje wzrost kryształów.2.Metoda siedzącej kropli.Technika podobna do  wiszącej kropli.Kropla umieszczana jest na silikonowanej płytce, którą umieszcza się na podstawce wzbiorniku z roztworem.3.Dializa.Roztwór białka jest oddzielony od roztworu zewnętrznego za pomocą półprzepuszczalnejmembrany.Wyrównywanie stężeń precypitanta pomiędzy rozdzielonymi membraną częściaminaczynia powoduje wzrost kryształów.4.Batch crystallization.Krystalizator jest wypełniany roztworem nienasyconym.Przesycenie jest osiągane przez stopniowe ochładzanie roztworu.Kryształy o określonym rozkładzie rozmiarów uzyskuje się dzięki określonemuprzebiegowi procesu zmiany temperatury w funkcji czasu.5.Mikroposiew.Pobranie kryształu z kropli.Mycie kryształu.Posiew w zrównoważonej kropli będącej w fazie metastabilnej.Metoda stosowana dla białek, które krystalizują łatwo, ale mają tendencję do tworzeniamałych kryształów.6.Makroposiew.Technika podobna do mikroposiewu.Różnica  kryształ nie nadający się do badań dyfrakcyjnych jest kruszony.Następnie pobierane są jego fragmenty i umieszczane w kropli będącej w faziemetastabilnej.Kryształy białkoweKryształ to obiekt posiadający symetrię translacyjną.Symetrie tworów skończonych to tzw.symetrie punktowe zachowujące przynajmniej jeden punkt wprzestrzeni (figura przekształca się na siebie).Należą do nich:Obroty o kąt , najczęściej równa się 2, 3, 4, lub 6.Inwersje względem punktu 0  przekształcenie, w którym punkt P1 przechodzi w punkt P2,takie, że OP1=-OP2.Obroty inwersyjne  złożenie obrotu i inwersji względem punktu leżącego na osi obrotu